Un microbe seul est invisible, mais posé sur un milieu où il se multiplie, il devient une tache que tu peux compter : une colonie pour une bactérie ou une levure, une plage de lyse (un trou clair dans un tapis de bactéries) pour un virus de bactérie. Tu comptes les taches d'une boîte, puis tu remontes à l'échantillon avec $N = \dfrac{n}{V \times d}$, où $n$ est le nombre de taches, $V$ le volume étalé et $d$ la dilution. Exemple : 120 colonies sur une boîte qui a reçu 0,1 mL de la dilution $10^{-4}$ donnent $\dfrac{120}{0{,}1 \times 10^{-4}} = 1{,}2 \times 10^{7}$ UFC par millilitre, l'UFC étant une « unité formant colonie ».
Reste à savoir quelles boîtes garder, et comment combiner deux dilutions.
Faire pousser pour voir : colonies et plages
Une bactérie mesure de l'ordre du micromètre : impossible de la voir à l'œil nu. Déposée sur une gélose, un milieu nutritif solidifié, elle se divise sur place, encore et encore, et ses descendantes s'entassent au même endroit. Après incubation, l'amas se voit : c'est une colonie. Une levure fait de même sur gélose Sabouraud, un milieu adapté aux champignons.
Un virus ne pousse sur aucune gélose : il ne se multiplie que dans une cellule vivante. Pour compter des bactériophages, les virus des bactéries, tu les mets au contact de bactéries sensibles, puis tu ajoutes une gélose molle encore liquide (le « top agar ») et tu coules le tout sur une gélose ordinaire : c'est la technique en double couche. Les bactéries y forment un tapis trouble. Là où un phage a infecté une bactérie, ses descendants tuent les voisines de proche en proche et ouvrent un trou clair dans le tapis : une plage de lyse, qu'on compte en UFP (unités formant plage).
Ce que compte vraiment une UFC
Une colonie part d'une unité, pas forcément d'une cellule. Une chaînette de streptocoques ou un amas de staphylocoques ne donne qu'une colonie. Chez une moisissure, une colonie peut naître d'une spore comme d'un fragment de filament. D'où le nom : unité formant colonie.
Dans l'autre sens, une cellule morte ne forme rien, et une cellule vivante qui ne pousse pas sur ce milieu, à cette température, non plus. Le dénombrement sur gélose compte donc les cellules cultivables dans tes conditions, pas toutes celles qui sont là. Pour compter toutes les cellules, vivantes ou mortes, il faut un comptage direct, par exemple au microscope dans une cellule de comptage.
Piège classique : écrire « $1{,}2 \times 10^{7}$ bactéries par mL ». Ton résultat est en UFC/mL, et il reste en général en dessous du nombre réel de cellules. Même prudence pour les phages : une particule virale incapable d'infecter ne creuse aucune plage, donc l'UFP compte les virus infectieux, pas tous les virus.
Les dilutions décimales
Un échantillon peut contenir des centaines de millions de microbes par millilitre : étalé tel quel, il couvre la boîte d'un tapis où plus rien ne se compte. À l'inverse, avec trois colonies, le résultat est fragile : le hasard du prélèvement pèse trop. Il te faut une boîte lisible.
On dilue donc au dixième, en cascade : 1 mL d'échantillon dans 9 mL de diluant stérile donne la dilution $10^{-1}$, 1 mL de ce tube dans 9 mL donne $10^{-2}$, et ainsi de suite. On étale ensuite un petit volume, souvent 0,1 mL, de plusieurs tubes.
Les boîtes à garder dépendent du protocole. Le sujet de biotechnologies des concours agronomiques et vétérinaires compte jusqu'à 300 colonies par boîte et, pour combiner deux dilutions, exige qu'une boîte en ait plus de 15. Un sujet de bac STL de l'académie de Versailles retient les boîtes de 10 à 100 plages de phages. Dans l'agroalimentaire, le dénombrement relève de la norme NF EN ISO 7218, révisée en juillet 2024 (AFNOR). En TP, suis les bornes de ton protocole.
Le calcul, et d'où vient le 1,1
Une boîte a reçu $V$ mL du tube de dilution $d$, donc $V \times d$ mL de l'échantillon d'origine. La concentration, c'est le nombre de colonies divisé par ce volume.
Formule : avec une seule boîte retenue,
$$N = \frac{n}{V \times d}$$
avec $N$ en UFC/mL, $n$ le nombre de colonies, $V$ le volume étalé en mL et $d$ la dilution du tube, par exemple $10^{-5}$.
Diviser par $d = 10^{-5}$ revient à multiplier par $10^{5}$. Et garde $V$ : avec 0,1 mL étalé, l'oublier rend ton résultat dix fois trop petit.
Quand deux dilutions successives sont lisibles, additionne toutes les colonies et divise par tout le volume d'échantillon d'origine étalé. La boîte la moins diluée en a reçu $V \times d$, la suivante dix fois moins, soit $0{,}1 \times V \times d$ : en tout, $1{,}1 \times V \times d$.
Formule : avec deux dilutions successives, une boîte chacune,
$$N = \frac{\sum c}{V \times 1{,}1 \times d}$$
avec $\sum c$ la somme des colonies et $d$ la dilution de la boîte la moins diluée. Avec $n_1$ boîtes à la première dilution et $n_2$ à la seconde, $1{,}1$ devient $n_1 + 0{,}1\,n_2$.
Piège classique : faire la moyenne des colonies des deux boîtes, puis la diviser par le volume d'une seule. La plus diluée a reçu dix fois moins d'échantillon : additionne les colonies et additionne les volumes, c'est tout le sens du $1{,}1$.
Le résultat s'écrit avec deux chiffres significatifs, un nombre de 1,0 à 9,9 multiplié par la puissance de 10 qui convient : $3{,}7 \times 10^{6}$ UFC/mL, et non 3 727 273 UFC/mL.
Conseil : d'une dilution à la suivante, le nombre de colonies doit être divisé par 10 environ. Avec 180 colonies à $10^{-4}$ et 90 à $10^{-5}$, soupçonne une erreur de pipetage ou une contamination avant de calculer.
Exercices corrigés
Les données sont fictives. Sauf mention contraire, une boîte compte si elle porte 300 colonies au plus, et deux dilutions se combinent si l'une des boîtes en a plus de 15.
Exercice 1 : Un lait fermenté est dilué en cascade au dixième, et on étale 0,1 mL du seul tube $10^{-6}$ sur une gélose. Après incubation, on compte 87 colonies. Calcule la concentration du lait fermenté en UFC/mL.
Correction :
Une seule boîte, donc $N = \dfrac{n}{V \times d}$.
$$N = \frac{87}{0{,}1 \times 10^{-6}} = \frac{87}{10^{-7}} = 8{,}7 \times 10^{8} \text{ UFC/mL}$$
Exercice 2 : Une suspension bactérienne est diluée au dixième. On étale 0,1 mL des tubes $10^{-3}$, $10^{-4}$ et $10^{-5}$, une boîte par tube, et on compte plus de 300 colonies, puis 152, puis 14. Un camarade écrit : « moyenne : $\dfrac{152 + 14}{2} = 83$ colonies, donc $N = \dfrac{83}{0{,}1 \times 10^{-4}} = 8{,}3 \times 10^{6}$ UFC/mL ». Trouve son erreur et donne le bon résultat.
Correction :
La boîte $10^{-3}$ dépasse 300 colonies : elle est écartée. Les boîtes $10^{-4}$ et $10^{-5}$ viennent de deux dilutions successives, et l'une dépasse 15 colonies : on les combine.
L'erreur : la boîte $10^{-5}$ a reçu dix fois moins d'échantillon que l'autre, donc ses 14 colonies ne pèsent pas autant que les 152. On additionne colonies et volumes, avec $d = 10^{-4}$, la dilution la moins forte :
$$N = \frac{152 + 14}{0{,}1 \times 1{,}1 \times 10^{-4}} = \frac{166}{1{,}1 \times 10^{-5}} \approx 1{,}5 \times 10^{7} \text{ UFC/mL}$$
Le résultat du camarade était presque deux fois trop faible.
Exercice 3 : Tu prépares 5 mL d'une suspension de phages pour un TP et tu la titres en double couche, avec 0,1 mL de chacune des dilutions $10^{-6}$, $10^{-7}$ et $10^{-8}$. Après incubation, la boîte $10^{-6}$ est entièrement claire, la boîte $10^{-7}$ porte 64 plages et la boîte $10^{-8}$ en porte 7. Ton protocole retient les boîtes de 10 à 100 plages. Calcule le titre de la suspension en UFP/mL, puis le nombre de phages infectieux dans les 5 mL.
Correction :
La boîte $10^{-6}$ n'a plus de tapis où compter, et 7 plages, c'est moins que 10 : seule la boîte $10^{-7}$ est retenue. Une seule boîte, donc pas de $1{,}1$ :
$$N = \frac{64}{0{,}1 \times 10^{-7}} = 6{,}4 \times 10^{9} \text{ UFP/mL}$$
Dans 5 mL : $6{,}4 \times 10^{9} \times 5 = 3{,}2 \times 10^{10}$ UFP, soit $3{,}2 \times 10^{10}$ phages infectieux.
À retenir
À retenir :
- Un microbe devient visible en se multipliant : colonie pour une bactérie ou une levure, plage de lyse pour un phage.
- UFC et UFP comptent des unités capables de se multiplier, pas toutes les cellules ni tous les virus.
- Une boîte : $N = \dfrac{n}{V \times d}$. Deux dilutions successives : $N = \dfrac{\sum c}{V \times 1{,}1 \times d}$, jamais la moyenne des colonies.
- Les bornes des boîtes retenues viennent de ton protocole.
- Le résultat s'écrit avec deux chiffres significatifs, en notation scientifique.
Sources
- Concours agronomiques et vétérinaires, épreuve pratique de SVT-biotechnologies, sous-épreuve de biotechnologies, sujet « Dénombrement de microorganismes, contrôle qualité d'un probiotique » : sujet sur concours-agro-veto.fr.
- Académie de Versailles, baccalauréat STL spécialité biotechnologies, épreuve orale de contrôle, sujet Y « Bactériophages et eau de rivière », décembre 2021 : sujet sur ac-versailles.fr.
- AFNOR, norme NF EN ISO 7218, version de juillet 2024 : fiche sur boutique.afnor.org.