La PCR (polymerase chain reaction, amplification en chaîne par polymérase) recopie un seul segment d'ADN, celui que bornent deux amorces, en répétant un cycle de trois températures : vers 95 °C pour séparer les brins, un peu plus bas pour fixer les amorces, vers 72 °C pour que l'enzyme recopie. Chaque cycle double au mieux le nombre de copies : après $n$ cycles, $N_n = N_0 \times 2^n$. En partant de mille copies, 30 cycles en donnent en théorie $1\,000 \times 2^{30} \approx 1{,}07 \times 10^{12}$.
Le mélange réactionnel
Tout se passe dans un tube placé dans un thermocycleur, l'appareil qui enchaîne les températures programmées.
| Ingrédient | Son rôle |
|---|---|
| ADN matrice | porte la séquence cible |
| Deux amorces | brins d'ADN de synthèse, de 18 à 30 nucléotides le plus souvent, complémentaires des deux bords de la cible |
| dNTP | désoxyribonucléotides triphosphates, briques du nouveau brin |
| Taq polymérase | ADN polymérase de la bactérie Thermus aquaticus, qui résiste à 95 °C |
| Tampon et $\text{Mg}^{2+}$ | le tampon tient le pH ; la polymérase exige du magnésium, mais un excès rend la PCR moins spécifique |
Règle : une ADN polymérase ne démarre jamais seule. Elle ajoute des nucléotides à l'extrémité 3' d'un brin déjà apparié à la matrice : elle allonge une amorce, toujours dans le sens 5' vers 3'.
Les deux amorces se fixent chacune sur un brin, extrémités 3' tournées l'une vers l'autre. Chaque brin neuf part donc d'une amorce et file vers le site de l'autre : c'est ce qui borne le segment copié, l'amplicon. Pour partir d'un ARN, une transcriptase inverse le recopie d'abord en ADN complémentaire (ADNc) : c'est la RT-PCR.
Un cycle en trois températures
Étape 1 : dénaturation, vers 95 °C. La chaleur rompt les liaisons hydrogène entre bases complémentaires : les deux brins se séparent, et chacun devient une matrice.
Étape 2 : hybridation, environ 5 °C sous la Tm des amorces, leur température de fusion (celle où la moitié des duplex amorce-matrice est dissociée). Comme elles sont en large excès, les amorces trouvent leurs séquences complémentaires avant que les brins de la matrice se réapparient.
Étape 3 : élongation, vers 72 °C. La Taq allonge chaque amorce ; une minute suffit pour un produit jusqu'à 2 kb (deux mille paires de bases).
Trop basse, cette température d'hybridation laisse les amorces se fixer sur des séquences presque complémentaires : des produits parasites apparaissent. Trop haute, elles tiennent mal et le rendement chute. Le bon réglage part de la Tm calculée et se termine par l'expérience.
Piège classique : après le premier cycle, tu n'as encore aucune molécule à la taille exacte de l'amplicon. La Taq ne s'arrête pas au bord de la cible : les brins neufs sont « longs », bornés d'un seul côté. Les premières molécules bornées des deux côtés n'apparaissent qu'au troisième cycle. Elles dominent vite, car les brins longs n'augmentent que de deux par cycle : en partant d'une molécule, on compte $2^n - 2n$ molécules à la bonne taille après $n$ cycles.
Compter les copies
Une molécule double brin en donne deux par cycle, puisque chacun de ses brins sert de matrice. En réalité, seule une fraction $E$ des molécules est copiée à chaque cycle : c'est l'efficacité, comprise entre 0 et 1.
Formule : avec $N_0$ copies au départ et une efficacité $E$, après $n$ cycles,
$$N_n = N_0 \times (1 + E)^n$$
Avec $E = 1$, soit 100 %, on retrouve $N_0 \times 2^n$. Pour estimer de tête : $2^{10} = 1\,024 \approx 10^3$, donc 30 cycles multiplient par un milliard environ.
Ce doublement ne dure pas. Les dNTP et les amorces s'épuisent, l'enzyme s'use à force de passer à 95 °C, et les produits, très nombreux, se réapparient entre eux plutôt qu'avec des amorces. La courbe s'aplatit : c'est le plateau. La quantité finale reflète donc mal la quantité de départ, et une mesure se fait pendant la phase exponentielle.
La qPCR et le Cq
La qPCR, ou PCR quantitative en temps réel, ajoute un marqueur fluorescent : un colorant qui se fixe sur l'ADN double brin, comme le SYBR Green I, ou une sonde d'hydrolyse propre à la cible. La fluorescence, mesurée à chaque cycle, croît avec la quantité de produit.
Définition : le Cq (cycle de quantification) est le cycle, souvent non entier, où la fluorescence franchit un seuil fixé. On le trouve aussi sous le nom de Ct (threshold cycle) : c'est la même valeur.
Plus il y a de cible au départ, plus le seuil arrive tôt, et plus le Cq est petit.
Au seuil, la quantité de produit atteint une valeur fixe $N_s$, donc $N_0 (1+E)^{\mathrm{Cq}} = N_s$. Avec le logarithme décimal :
$$\mathrm{Cq} = -\frac{1}{\log(1+E)} \log N_0 + \frac{\log N_s}{\log(1+E)}$$
Le Cq est une fonction affine de $\log N_0$, de pente $a = -\dfrac{1}{\log(1+E)}$, d'où $E = 10^{-1/a} - 1$. Avec $E = 1$, $a = -\dfrac{1}{\log 2} \approx -3{,}32$ : diluer 10 fois retarde le Cq de 3,32 cycles.
D'où la gamme étalon : des dilutions de quantité connue donnent une droite, dont la pente fournit l'efficacité et qui convertit le Cq d'un échantillon en quantité (méthode décrite par les recommandations internationales MIQE 2.0).
Piège classique : un Cq plus grand signifie moins de cible, pas plus. Et le Cq n'est pas inversement proportionnel à la quantité : c'est une fonction affine décroissante de son logarithme, qui perd environ 3,3 cycles chaque fois que la quantité est multipliée par 10, à 100 % d'efficacité.
Lire un gel et ses témoins
Après une PCR classique, les produits migrent dans un gel d'agarose soumis à un champ électrique. L'ADN, chargé négativement par ses phosphates, va vers l'anode (+), et le gel agit comme un tamis : les petits fragments avancent plus vite. Un marqueur de taille, fait de fragments de longueurs connues, migre à côté : la bande doit avoir la taille de l'amplicon.
Une bande ne prouve rien sans témoins. Le témoin négatif contient tout sauf l'ADN matrice : une bande y signale une contamination. Le témoin positif porte une cible connue : s'il reste vide, la réaction a échoué, et un échantillon sans bande ne peut pas être déclaré négatif. Enfin, une bande très courte, en bas du gel, vient souvent de dimères d'amorces, des amorces hybridées entre elles puis allongées.
Exercices corrigés
La PCR fait partie des bases de biologie moléculaire de la ressource R3.03 « Génétique et biologie moléculaire », au semestre 3 du programme national du BUT Génie biologique. Cherche chaque exercice avant d'ouvrir sa correction.
Exercice 1 : Un tube contient 200 copies de la cible. Combien de copies obtiens-tu après 25 cycles avec une efficacité de 100 %, puis de 90 % ?
Correction :
À 100 % : $N_{25} = 200 \times 2^{25} = 200 \times 33\,554\,432 \approx 6{,}7 \times 10^9$ copies.
À 90 % : $N_{25} = 200 \times 1{,}9^{25} \approx 1{,}9 \times 10^9$ copies, environ 3,6 fois moins. Dix points d'efficacité perdus divisent le résultat par plus de trois.
Exercice 2 : Une seule molécule d'ADN double brin porte la cible, et l'efficacité vaut 100 %. Combien de molécules ont la taille exacte de l'amplicon après 1, 2, 3 puis 30 cycles ?
Correction :
On applique $2^n - 2n$ : $2 - 2 = 0$ après 1 cycle, $4 - 4 = 0$ après 2 cycles et $8 - 6 = 2$ après 3 cycles. Les deux premiers cycles ne fabriquent que des brins longs : c'est le piège.
Après 30 cycles : $2^{30} - 60 = 1\,073\,741\,764$ molécules à la bonne taille, sur $2^{30} = 1\,073\,741\,824$ en tout. Les 60 autres sont négligeables.
Exercice 3 : (données fictives) Deux prélèvements A et B passent dans la même qPCR, d'efficacité 100 %. On lit $\mathrm{Cq}_A = 22{,}0$ et $\mathrm{Cq}_B = 25{,}0$. Lequel contenait le plus de cible, et combien de fois plus ? Quel Cq attends-tu pour B dilué 10 fois ?
Correction :
Le plus petit Cq signale le plus de cible : c'est A. Trois cycles d'écart, à 100 %, font un facteur $2^3 = 8$ : A contenait 8 fois plus de cible que B.
Diluer 10 fois retarde le Cq de $\dfrac{1}{\log 2} \approx 3{,}32$ cycles. On attend donc $\mathrm{Cq} \approx 25{,}0 + 3{,}3 = 28{,}3$.
Exercice 4 : (données fictives) Une gamme étalon donne un Cq de $15{,}1$ pour $10^6$ copies, $18{,}5$ pour $10^5$, $21{,}9$ pour $10^4$, $25{,}3$ pour $10^3$ et $28{,}7$ pour $10^2$. Calcule la pente $a$ de la droite donnant le Cq en fonction de $\log N_0$, puis l'efficacité. Un échantillon donne un Cq de $23{,}6$ : combien de copies contenait-il ?
Correction :
Chaque fois que $\log N_0$ baisse de 1, le Cq augmente de $3{,}4$. La pente vaut $a = -3{,}40$, et $E = 10^{1/3{,}40} - 1 \approx 1{,}968 - 1 = 0{,}968$, soit environ 97 %.
La droite s'écrit $\mathrm{Cq} = -3{,}40 \log N_0 + b$. Le point $(6\,;15{,}1)$ donne $b = 15{,}1 + 3{,}40 \times 6 = 35{,}5$. Pour un Cq de $23{,}6$ : $\log N_0 = \dfrac{35{,}5 - 23{,}6}{3{,}40} = 3{,}5$, donc $N_0 = 10^{3{,}5} \approx 3{,}2 \times 10^3$ copies.
À retenir
À retenir :
- La polymérase n'allonge qu'une amorce hybridée, de 5' vers 3' : les deux amorces bornent l'amplicon.
- Un cycle : vers 95 °C, environ 5 °C sous la Tm des amorces, puis vers 72 °C.
- $N_n = N_0 \times (1+E)^n$ pendant la phase exponentielle, puis vient le plateau.
- Les molécules à la taille exacte n'apparaissent qu'au troisième cycle.
- Un petit Cq signale beaucoup de cible, et $E = 10^{-1/a} - 1$ avec $a$ la pente de la droite étalon.
- Pas de conclusion sans témoin négatif ni témoin positif.
Sources
- Programme national du BUT Génie biologique (programmes nationaux 2022, mis à jour en 2023), ressource R3.03 : texte sur enseignementsup-recherche.gouv.fr.
- Bustin et coll., « MIQE 2.0 », Clinical Chemistry, vol. 71, n° 6, 2025, p. 634 à 651 : article sur academic.oup.com.